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培養成體干細胞和人多能干細胞的突變影響

標簽:成體干細胞

未分化和專業化細胞的無限供給,成體干細胞和多能干細胞衍生類器官保持在再生醫學的巨大潛力。此外,干細胞已成為藥理學和毒理學無價工具用于體外測試。維持培養中基因組完整性是成功應用干細胞的前提,因為不需要的突變可能會影響藥物反應和毒理學測量,或者可能導致移植后致癌性轉化。


成體干細胞


然而,多個研究已經確定復發性基因組改變源于常規培養的人的ASC和省電類別。盡管這些研究表明在培養中干細胞的基因組完整性降低了,但這些研究中的大多數已通過分辨率有限的方法在批量培養中進行。由于只能檢測到大多數細胞中共有的突變,因此對大量樣品的分析提出了重要的限制。這導致偏向那些賦予細胞選擇性優勢的基因組改變,或那些在培養過程中較早發生的改變,而培養過程本身的突變影響和負責任的突變機制仍不清楚。更好地了解培養中活躍的突變過程可能使我們能夠通過改變培養條件來改善培養中的基因組穩定性。


我們近期建立了一種方法,該方法通過將全基因組測序(WGS)與體外克隆擴增相結合,以堿基對的分辨率準確地識別單個干細胞體內獲得的體細胞突變。簡而言之,將干細胞作為單細胞播種并繁殖以獲得足夠的細胞用于DNA分離和隨后的WGS。進行生物信息學分析,以高可信度鑒定出原始細胞中存在的那些突變(單核苷酸變異,插入缺失,拷貝數變異,結構變異(SV)和非整倍性),并濾除單次雜交后發生的種系變異和亞克隆變異-cell步驟。用這種方法,避免了體外擴增方法的高噪聲率,這使得每個基因組少于一百個突變的可靠檢測成為可能。將所得的全基因組突變譜和分配已顯示出提供新的見解在體內和CRISPR / Cas9編輯類器官中的成體干細胞的特定突變和DNA修復過程的活性。


在這里,我們采用了這種方法來系統地測量體外培養物對三種人干細胞類型的個體細胞的突變影響,這些人干細胞類型是根據藥理學,毒理學和再生醫學的相關性而選擇的:PSC,肝ASC和腸道ASC。我們的研究表明,體外培養導致突變率提高,并留下了與氧化應激相關的獨特但常見的突變足跡,而這種足跡與干細胞類型無關。此外,我們證明了在降低的氧氣張力下培養可減少與氧化應激相關的突變量。我們使用測得的定量和定性突變特征來建模全基因組突變積累,并進行與干細胞的體外和體內應用相關的遺傳風險評估。


其結果培養期間PSC和ASC中的突變積累,為了公正地研究標準培養條件對干細胞基因組的突變影響,我們首先建立了克隆人PSC和ASC品系。建立了一個多能胚胎干細胞系,兩個誘導的PSC系,兩個肝ASC系和兩個腸道ASC系的克隆。每個克隆系培養約2–5個月(補充數據 ),在此期間允許積累突變。


隨后,執行第 二個克隆步驟以生成所謂的亞克隆,這些亞克隆用于確定導致這些亞克隆的單個細胞中存在的突變。將克隆,亞克隆和匹配的非克隆參考樣品進行WGS處理。從亞克隆中排除所有種系變體和在第 一步克隆之前積累的變體。根據低等位基因頻率(VAF),通過生物信息學方法將第二個克隆步驟后體外產生的變體濾除。這種方法使我們能夠專門測量在兩個克隆步驟之間的培養期間累積的突變。


在特定數量的群體倍增后,可以實現特定應用(例如細胞療法或藥物研究)所需的干細胞總數,該倍數由細胞分裂率和細胞死亡率決定。因此,從實際的角度來看,關于每群體倍增的突變率的知識比每時間單位的突變數更具信息性。因此,我們確定了在相同條件下所有細胞類型的種群倍增率,這些條件也用于突變積累實驗。我們發現人類PSC的種群倍增時間約為23小時,這大約是人類肝臟和腸道ASC種群倍增時間分別約為46和44h的兩倍。


通過測序讀取深度覆蓋范圍分析了所有三種干細胞類型的所有克隆和亞克隆的核型,發現它們是正常的,沒有任何明顯的染色體異常??偣?,我們在15個亞克隆中檢測到283個小插入和缺失(indels)。在不同的干細胞類型之間,每個群體每個基因組中每個基因組的插入缺失數量沒有統計上的顯著差異(ANOVA,p ?= 0.15)?;蚪M分布分析顯示,插入缺失對CDS沒有影響,但人類胚胎干細胞系亞克隆中一個插入缺失導致CDKN1C移碼突變。


我們確定了15個亞克隆所共有的4,517個單堿基對取代(SBS)。肝ASCs每個群體每個基因組獲得8.3±3.6 SBS的數量加倍。在腸道ASC中,突變積累率與每個群體每個基因組7.2±1.1 SBS加倍相似。PSC中的SBS數量比ASC中的SBS數量少,每個群體每個基因組的基因組突變有3.5±0.5倍(ANOVA,p ?= 0.006)。為了與體內突變率進行比較,我們還計算了兩種ASC類型每年的突變率。單個腸道ASC每年積累1415±212個突變,肝干細胞每年積累1588±679個突變。這些值比每年大約40 SBS的體內突變積累率高近40倍。這些發現表明標準的體外培養條件對突變積累率有很大的影響。


對于所有三種干細胞類型,SBS的基因區域均被大量消耗。消耗不限于蛋白質編碼序列,還包括非編碼序列,表明基因區域中的消耗主要是由于基因區域中增強的修復活性而不是通過針對有害突變的選擇引起的。在所有三種干細胞類型中,編碼序列的消耗約為2%??偣?,我們在所有樣本中鑒定出19個非同義突變,PSC中有8個,肝ASC中有2個,腸ASC中有9個。根據人類癌癥基因普查,這些非同義詞突變均未影響已知的癌癥基因或之前已描述在培養物中,以賦予在干細胞的選擇性優勢。


在啟動子區中的突變可影響基因的活性,從而有助于疾病。在所有三種干細胞類型的啟動子或啟動子側翼區域中,特別是在腸道ASC中,突變都被消除了。通常認為異染色質的突變是無害的,因為影響功能元件的風險很低。在所有三種干細胞類型中,突變都顯著富集于異色層粘連蛋白相關結構域,重編程過程中出現的突變就是這種情況。因此,在所有三種干細胞類型中,功能相關的基因組區域似乎更不受突變積累的保護,而異色LAD更易于突變積累。


廣州多能—走進2020創交會

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2020年9月23日,多能干細胞科技(廣州)有限公司受邀走進由中國科協、國家發展改革委、中國科學院、中國工程院、九三學社中央和廣東省人民政府、廣州市人民政府主辦,廣州市人民政府、國際數據集團承辦的2020中國創新創業成果交易會(下稱:創交會)在廣州正式開幕。

2019-01-13

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